Nella coltura cellulare, l'ossigeno non è un semplice gas di supporto: è un parametro di processo. Quando la densità cellulare aumenta, l’aria da sola non è più sufficiente a mantenere il livello di ossigeno disciolto previsto. La sfida non consiste nell’ossigenare di più, ma nell’ossigenare in modo corretto e riproducibile, dalla prima prova fino all’intera campagna di sviluppo.
Nei laboratori di sviluppo di processi biofarmaceutici, la gestione dell’ossigeno disciolto (DO) determina la crescita, la vitalità e, spesso, la qualità del prodotto. Ecco come funziona il controllo dell’ossigeno nel bioreattore, in quali applicazioni l’ossigeno ad alta purezza offre una reale flessibilità e quali criteri sono importanti al momento di scegliere la fonte.
Perché l’aria non è più sufficiente?
Le cellule dei mammiferi consumano ossigeno in modo continuo. Man mano che la densità cellulare vitale e la velocità di consumo di ossigeno (OUR) aumentano, il trasferimento gas-liquido ottenuto con la sola aria può diventare insufficiente a mantenere il valore di riferimento di DO del processo.
I bioreattori moderni rispondono con una cascata di controllo: il regolatore agisce innanzitutto sull’agitazione e sulla portata d’aria, quindi aggiunge ossigeno solo quando necessario.
- Base: aria o gas di testa, sufficiente a bassa densità cellulare.
- Controllo primario: l'agitazione e la portata d'aria aumentano il trasferimento di ossigeno.
- Arricchimento di O₂: aria + ossigeno supplementare quando viene raggiunta la portata massima d'aria.
- Retroazione: la sonda di DO e il regolatore regolano continuamente l’apporto di gas in base al setpoint.
In questa logica, l’ossigeno non è un’ulteriore regolazione: è l’ultimo margine di manovra che consente di mantenere il processo senza compromessi.
Controllare l’ossigeno, non massimizzarlo
I processi CHO pubblicati per gli anticorpi monoclonali operano con setpoint di DO pari al 20%, 40% o 50% della saturazione dell’aria, mantenuti tramite sparging di ossigeno o miscele aria-ossigeno. L’obiettivo è una disponibilità di ossigeno controllata, mai la concentrazione più elevata possibile.
Una fonte di ossigeno non “sovraossigena” quindi la coltura. Essa fornisce al sistema di gas del bioreattore il gas necessario alla strategia di controllo, ed è il regolatore a decidere quando e quanto aggiungerne per mantenere il valore di riferimento convalidato.
Questo aspetto è importante anche per le colture intensificate. Aumentare solo la portata d’aria comporta dei compromessi: taglio legato alle bolle, formazione di schiuma, ricorso ad antischiuma e strippaggio di CO₂. Arricchire il gas in ingresso con ossigeno consente di fornire un trasferimento supplementare senza aumentare il volume di gas nelle stesse proporzioni.
Dove l’ossigeno ad alta purezza cambia le carte in tavola nella R&S
Anticorpi monoclonali e sviluppo di processi CHO
Le cellule CHO sono una delle principali piattaforme di espressione degli anticorpi terapeutici. Nel processo fed-batch, la biomassa in crescita fa aumentare notevolmente la domanda di ossigeno. Una volta raggiunto il limite massimo di portata d’aria, l’ossigeno supplementare consente al regolatore di mantenere il DO senza dipendere esclusivamente da una portata totale più elevata. Recenti studi di scale-up, come quello di Lemire et al. (Biotechnology Progress, 2026), descrivono in dettaglio una cascata che fornisce ossigeno puro su richiesta una volta superato tale limite.
- Screening di cloni e terreni di coltura in bioreattori controllati
- Ottimizzazione dei processi fed-batch
- Valutazione dei setpoint di DO e delle cascate di aerazione
- Modelli ridotti (scale-down) dei processi di produzione
- Studi che mettono in relazione strategia di aerazione, crescita, vitalità, titolo e qualità del prodotto
Proteine ricombinanti
Gli stessi principi si applicano ad altri sistemi di espressione aerobici: enzimi, proteine di fusione, frammenti di anticorpi e altri prodotti biologici. Una fonte di ossigeno dedicata garantisce la ripetibilità degli esperimenti, poiché la densità cellulare e il consumo di ossigeno variano nel corso del ciclo, in particolare nelle colture fed-batch o in perfusione di lunga durata.
Colture ad alta densità e intensificate
Il fed-batch intensificato e la perfusione raggiungono elevate densità cellulari vitali, con conseguente forte fabbisogno di ossigeno. Per un team di R&S, il valore aggiunto è la flessibilità: confrontare i livelli massimi di aria, le strategie di arricchimento, l’agitazione e le configurazioni degli sparger, con una fonte di ossigeno riproducibile da una campagna all’altra.
Scale-up, scale-down e strategie di aerazione
Il trasferimento di ossigeno è un parametro fondamentale nel cambio di scala. I team utilizzano reattori da banco e mini-bioreattori per riprodurre i vincoli relativi al trasferimento di ossigeno e alla gestione dei gas presenti nei serbatoi di dimensioni maggiori. Un apporto controllato di O₂ consente di studiare in modo sistematico il kLa, il consumo di ossigeno, l’agitazione, la portata del gas e l’eliminazione della CO₂.
- Reattori da banco per lo sviluppo da 1 a 10 L
- Sistemi di mini-bioreattori ad alta portata
- Modelli in scala ridotta di processi di produzione
- Skid pilota per lo sviluppo di processi
- Confronto tra strategie di sparging e agitazione
La fonte di ossigeno: una scelta ormai strategica
In cicli di produzione che durano diversi giorni, o addirittura diverse settimane, la continuità dell’approvvigionamento di ossigeno è parte integrante dell’affidabilità sperimentale. Le bombole richiedono scorte, sostituzioni e una logistica di consegna. La produzione in loco risolve il problema: l’ossigeno viene generato dall’aria ambiente, proprio dove viene sviluppato il processo.
Per un laboratorio di ricerca e sviluppo, questo approccio presenta diversi vantaggi:
- Disponibilità continua durante le colture di lunga durata
- Minore dipendenza dalle scorte di bombole, dalle sostituzioni e dalle consegne
- Fonte stabile per campagne ripetute di piani sperimentali, screening di cloni e sviluppo di processi
- Integrazione compatta e silenziosa in prossimità delle piattaforme dei bioreattori
- Architettura scalabile man mano che aumenta il numero di bioreattori di ricerca
È in questo tipo di applicazione che si inserisce, ad esempio, la tecnologia ceramica ionica sviluppata originariamente con la NASA e implementata nei generatori da laboratorio come ION® di NOVAIR: fino al 99,9999% di purezza, 3 L/min e 6,89 bar (100 psi) nella configurazione di riferimento, prodotti a partire dall’aria ambiente in un formato compatto e silenzioso, con una capacità espandibile. Questo tipo di generatore va posizionato a monte dei misuratori di portata massica e del collettore di miscelazione dei gas del bioreattore, ovvero a monte del sistema di gestione dei gas convalidato.
Le specifiche sopra riportate corrispondono a una configurazione di riferimento. La compatibilità effettiva deve sempre essere verificata per ciascuna piattaforma di bioreattore.
Qualificazione e dimensionamento: due aspetti da non trascurare
La purezza da sola non basta. Non consente di stabilire l’idoneità di un gas per un bioprocesso regolamentato. Prima dell’uso, il laboratorio deve verificare i requisiti del produttore del bioreattore: purezza e impurità ammesse, strategia di filtrazione e sterilità, pressione, portata, materiali, raccordi e, se del caso, qualificazione GMP.
Il dimensionamento è la fase critica. Il consumo di ossigeno dipende fortemente dal volume del reattore, dalla densità cellulare vitale, dall’OUR, dal kLa, dallo sparger, dall’agitazione, dal setpoint di DO e dalla strategia a cascata. Gli studi pubblicati evidenziano fabbisogni molto bassi nei mini-bioreattori e nettamente più elevati all’aumentare della scala. Per confermare un dimensionamento, è necessario disporre almeno di:
- il modello di bioreattore e il suo volume di lavoro
- il numero di reattori
- l’intervallo massimo del misuratore di portata massica di O₂
- la pressione di ingresso richiesta
- il ciclo di funzionamento previsto
- le specifiche di qualità del gas
Al di là della ricerca e sviluppo, un grande bioreattore di produzione può richiedere una portata superiore a quella di una singola unità: il fabbisogno dipende quindi dall’applicazione.
L’ossigeno, un fattore chiave del processo piuttosto che un materiale di consumo
I team di ricerca e sviluppo nel settore biofarmaceutico hanno bisogno di controllare l’ossigeno, non di gestire le bombole. La produzione di ossigeno ad alta purezza direttamente dall’aria ambiente, a monte di un sistema di gas qualificato, supporta i laboratori che sviluppano anticorpi monoclonali, proteine ricombinanti e processi di coltura intensificati in cui l’ossigeno supplementare fa parte della strategia di controllo del DO.
La vera domanda non è più «quanto ossigeno fornire», ma «come disporre, in loco, di una fonte continua, riproducibile e dimensionata per il processo». Passare da un sistema di erogazione dell’ossigeno a un sistema di produzione dell’ossigeno è, per molti laboratori, la logica conseguenza di questa riflessione.
